Wayeal LCMS-TQ9200液体クロマトグラフィー-質量分析システムを用いた抗生物質発酵残渣中のエリスロマイシン残留物の測定

エリスロマイシンは、Streptomyces erythreusの発酵によって生成されるマクロライド系抗生物質です。その抗菌効果は、主に細菌のタンパク質合成を阻害することによって発揮されます。エリスロマイシンの製造は、主にバイオ発酵技術に依存しており、菌株選択、種培養、タンク内での大規模発酵、抽出、精製などのステップが含まれます。発酵後、エリスロマイシンは有機溶媒（酢酸ブチルなど）で抽出され、結晶化またはイオン交換樹脂分離によって精製され、最終的に臨床グレードの塩（エリスロマイシンエチルコハク酸エステルなど）が得られます。しかし、エリスロマイシンの製造プロセスでは、大量の菌糸体かす（発酵残渣）が生成され、これには残留抗生物質、微生物タンパク質、代謝副産物が含まれる可能性があります。適切に管理されない場合、これらの残渣は環境への排出や飼料添加物としての使用を通じて生態系に入り、複数の危険性をもたらす可能性があります。残留エリスロマイシンは、土壌や水域における抗生物質耐性遺伝子の拡散を促進し、微生物群集のバランスを乱す可能性があります。食物連鎖を通じて増幅され、動物や人間における耐性菌株の出現を誘発し、抗生物質の有効性を損なう可能性があります。さらに、残渣内の未利用の有機物は環境汚染を引き起こす可能性があります。したがって、菌糸体残渣の厳格な規制は、エリスロマイシン製造からの汚染を制御するための重要な措置です。

本実験は、「T/PIAC 00003—2021 中国医薬産業協会グループ標準 - 抗生物質残留物、有機肥料基材、作物、および環境媒体中のエリスロマイシンの測定方法」の標準を参照して実施され、Wayeal LCMS-TQ9200液体クロマトグラフィー質量分析システムを使用して、菌糸体かす中のエリスロマイシン含有量を測定しました。実験結果は、システムの適合性試験が良好なピーク形状と良好な直線性を示し、実験要件を満たしていることを示しています。

1. 機器と試薬

1.1 LCMSの構成リスト

表1 機器構成リスト

1.2 試薬と標準物質

表2 試薬と標準物質のリスト

1.3 実験材料と補助機器

超音波洗浄器

ボルテックスミキサー

高速遠心分離機

2. 実験方法

2.1 サンプル前処理

サンプル0.5g（0.001g単位で正確に）をガラス栓付き試験管に量り取ります。50mLのアセトニトリルを加え、混合物を均質化するために1分間ボルテックスし、20分間超音波アシスト抽出を行います。次に、混合物を50mL遠心分離管に移し、4000rpmで10分間遠心分離します。上清の適切な量を集め、0.22μmフィルター膜を通過させます。最初の濾液を少なくとも1mL廃棄し、残りの濾液をアンバーLCバイアルに移して分析します。

2.2 実験条件

2.2.1 液体クロマトグラフィー方法条件

クロマトグラフィーカラム：C18 1.7μm 2.1x50mm

移動相：A：アセトニトリル、B：0.1%ギ酸水溶液

流速：0.3mL/min

カラム温度：30℃

注入量：2μL

2.2.2 質量分析計方法条件

表3 質量分析イオン源パラメータ

3. 実験結果

3.1 システム適合性試験

システム適合性試験の結果は、外部ピークからの干渉がなく、明確に定義されたターゲットピークを示し、すべての実験要件を満たしていました。

図1 エリスロマイシンA標準溶液（0.5ng/mL）のクロマトグラム

3.2 直線範囲

エリスロマイシンAの検量線は、中間濃度作業溶液を使用して標準溶液を段階的に希釈することによって作成されました。この曲線は、0.5〜500ng/mLの範囲で優れた直線性を示し、相関係数（R²）は0.99を超えました。

表4 エリスロマイシンAの直線範囲

図2 エリスロマイシンAの検量線

3.3 検出限界（LOD）と定量限界（LOQ）

この方法では、エリスロマイシンA標準溶液の検出限界（LOD）と定量限界（LOQ）はそれぞれ0.2ng/mLと0.5ng/mLと決定されました。対応する信号対雑音比（S/N）は110.02と292.20であり、3と10の最小要件を大幅に上回り、実験感度基準を満たしています。

図3. エリスロマイシンAのLODとLOQの抽出イオンクロマトグラム

3.4 精密試験

エリスロマイシンA溶液を連続して7回注入し、結果を図に示しました。エリスロマイシンAの保持時間の偏差は0.19％、ピーク面積の偏差は0.96％であり、どちらも5％未満であり、実験要件を満たしています。

図4. エリスロマイシンAサンプルの精密クロマトグラム（7回の注入）

3.5 サンプルテスト

前述の前処理方法に従い、固形サンプル中のターゲットピーク面積は7.4E6でした。外部標準法により計算した結果、サンプル溶液中のエリスロマイシンA含有量は400ng/mLと決定されました。

図5 エリスロマイシンAサンプルテストのクロマトグラム

4. 結論

この方法は、Wayeal LCMS-TQ9200液体クロマトグラフィー質量分析システムを使用して、抗生物質発酵残渣中のエリスロマイシンA含有量を測定します。データは、この方法が優れた性能を示すことを示しています。すべてのクロマトグラフィーピークは、テーリングのない最適な形状を示し、感度は実験要件を満たしています。線形相関係数（R²）は0.99を超えています。7回の連続注入におけるすべての化合物の保持時間とピーク面積の偏差は1％以内であり、高い精度を示しています。サンプルクロマトグラムは、外部ピークからの干渉を示さず、測定されたサンプル含有量は400ng/mLです。この方法は、Wayeal LC-MS/MSシステムを搭載しており、試験サンプルの定性的および定量的分析の要件を満たしています。