2025-10-16
蒸発光散乱検出器（ELSD）は、気体粒子を形成できるあらゆる化合物に理論的に適用可能な新しい質量検出器です。2025年版の薬局方は、100種類以上の薬物の分析と品質管理に蒸発光散乱検出（ELSD）を使用することを規定しています。実際には、ELSDは、アストラガロシド、炭水化物、アミノグリコシド、コレステロールなど、紫外線（UV）吸収を持たない化合物に頻繁に適用され、UVおよび蛍光検出器の補完的な検出方法として機能することがよくあります。しかし、ELSDの結果は、移動相組成、有機溶媒濃度、溶出モード、噴霧条件など、複数の要因の影響を受けます。したがって、正確で一貫した分析結果を確保するためには、これらの要因が結果に及ぼす影響を評価することが不可欠です。
本研究では、2025年版薬局方のPart IIに記載されているスペクチノマイシン塩酸塩の分析方法を参照し、ICH QbD原則に準拠し、直交実験計画を用いて分析条件をスクリーニングし、最適化しました。
図1 スペクチノマイシン塩酸塩
2. 機器と方法
本研究では、Wayeal’s LC3200シリーズHPLCシステムを用いてクロマトグラフィー分析を行いました。機器構成には、四元グラジエントポンプ、オートサンプラー、カラムコンパートメント、および蒸発光散乱検出器が含まれていました。システム制御とデータ取得/処理は、SmartLab 2.0クロマトグラフィーソフトウェアを使用して行われました。
表1 HPLC条件
| クロマトグラフィーカラム | Nova Atom PC18 (4.6*250mm, 5μm) |
| 移動相 | 0.1mol/Lトリフルオロ酢酸水溶液 |
| 流速（mL/min） | 0.6 |
| カラム温度 | 35 |
| 注入量（μL） | 20 |
| ELSDネブライザー温度（°C） | 85 |
| ELSD蒸発器温度（°C） | 80 |
| ELSD検出温度（°C） | 50 |
| ガス流量（SLM） | 0.2 |
3. 溶液調製
試料溶液：スペクチノマイシン塩酸塩のストック溶液は、10 mg/mLの標識濃度と99.8%の純度でクライアントから提供されました。
0.1Mトリフルオロ酢酸水溶液：正確に6.8mLのトリフルオロ酢酸を1000mLメスフラスコにピペットで入れます。精製水で標線まで希釈し、よく混合します。最後に、使用前に0.45μmセルロース膜フィルターを通して溶液を真空ろ過します。
標準溶液：ストック溶液を精製水で希釈し、それぞれ0.15、0.25、0.35、0.50、および0.70mg/mLの濃度の試料溶液を調製しました。次に、各溶液を0.45μmセルロース膜フィルターに通してろ過してから使用しました。
4. 結果と考察
中国薬局方は、スペクチノマイシン塩酸塩のエントリーの下で、関連物質と主成分含有量を分析するために同一のクロマトグラフィー条件を採用しています。この方法は、「検出器は実際の状況に基づいて構成できる」と述べています。本研究では、ELSD3260の機器特性、分析方法の要件、および関連文献を考慮し、Plackett-Burman実験計画を用いて複数の実験パラメータをスクリーニングしました（表2および3）。その後、Box-Behnken計画（表4）を用いて、ELSD検出器のピーク面積応答を最適化しました。
表2 Plackett-Burman実験計画
| No. | 流速（mL/min） | カラム温度（°C） | ネブライザー温度（°C） | 蒸発器温度（°C） | 検出温度（°C） | ガス流量（SLM） | ポストカラム補正 |
| 1 | 0.8 | 35 | 60 | 50 | 50 | 0.4 | いいえ |
| 2 | 0.6 | 35 | 50 | 60 | 50 | 0.6 | いいえ |
| 3 | 0.6 | 30 | 60 | 60 | 50 | 0.4 | はい |
| 4 | 0.8 | 30 | 60 | 60 | 40 | 0.6 | いいえ |
| 5 | 0.6 | 35 | 60 | 50 | 40 | 0.6 | はい |
| 6 | 0.8 | 30 | 50 | 50 | 50 | 0.6 | はい |
| 7 | 0.8 | 35 | 50 | 60 | 40 | 0.4 | はい |
| 8 | 0.6 | 30 | 50 | 50 | 40 | 0.4 | いいえ |
表3 Plackett-Burman実験結果のANOVA分析
| 変動の要因 | 係数 | t値 | p値 | 有意性 |
| 流速 | -6.687 | -8.10 | <0.01 | 2 |
| カラム温度 | 0.191 | 0.22 | 0.824 | 6 |
| ネブライザー温度（°C） | 5.342 | 6.29 | <0.01 | 3 |
| 蒸発器温度（°C） | 4.135 | 4.87 | <0.01 | 4 |
| 検出温度（°C） | 0.171 | 0.21 | 0.842 | 7 |
| ガス流量（SLM） | -10.381 | -12.23 | <0.01 | 1 |
| ポストカラム補正 | -2.559 | -3.02 | <0.01 | 5 |
表3からわかるように、ガス流量、移動相流速、およびポストカラム補正は負の効果を示しました。具体的には、ガス流量と移動相流速を減らし、ポストカラム補正を無効にすることで、クロマトグラフィーピーク応答を増加させることができました。ただし、移動相流速を減らすと、ピークの広がりが増加し、検出感度が低下する可能性があります。したがって、流速は標準的な方法と一致するように維持されました。カラム温度と検出温度は正の効果を示しましたが、応答値を大幅に向上させることはありませんでした。したがって、その後の研究では、ガス流量、ネブライザー温度、および蒸発器温度の最適化に焦点を当てます。
応答曲面法フレームワーク内でBox-Behnken実験計画を採用することにより、ガス流量、ネブライザー温度、および蒸発器温度が応答値に及ぼす影響を調査しました。実験計画を表4に示します。
表4 Box-Behnken実験計画
| No. | ガス流量（SLM） | ネブライザー温度（°C） | 蒸発器温度（°C） |
| 1 | 0.15 | 75 | 80 |
| 2 | 0.15 | 85 | 80 |
| 3 | 0.25 | 75 | 80 |
| 4 | 0.25 | 85 | 80 |
| 5 | 0.15 | 80 | 75 |
| 6 | 0.15 | 80 | 85 |
| 7 | 0.25 | 80 | 75 |
| 8 | 0.25 | 80 | 85 |
| 9 | 0.2 | 75 | 75 |
| 10 | 0.2 | 75 | 85 |
| 11 | 0.2 | 85 | 75 |
| 12 | 0.2 | 85 | 85 |
| 13 | 0.2 | 80 | 80 |
スペクチノマイシン塩酸塩の検出条件は、応答曲面法（図2）を用いてピーク面積の変動をシミュレーションし、ネブライザー温度85°C、蒸発器温度80°C、検出器温度50°C、ガス流量0.2 SLMの機器パラメータ範囲を考慮して決定されました。
A. ガス流量と蒸発器温度がピーク面積に及ぼす影響
B. ガス流量とネブライザー温度がピーク面積に及ぼす影響
C. ネブライザー温度と蒸発器温度がピーク面積に及ぼす影響
図2 ピーク面積の変動
注入精度
スペクチノマイシン塩酸塩のストック溶液を0.35mg/mLに希釈し、指定されたクロマトグラフィー条件下で6回の連続注入を行い、クロマトグラムを記録しました。スペクチノマイシン塩酸塩のクロマトグラフィーピークの保持時間とピーク面積の相対標準偏差（RSD%）を計算しました。結果を表5に示します。
表5 注入精度試験結果
| No. | 保持時間（分） | ピーク面積（SU*s） |
| 1 | 7.625 | 259.124 |
| 2 | 7.615 | 245.223 |
| 3 | 7.618 | 270.250 |
| 4 | 7.608 | 237.267 |
| 5 | 7.627 | 254.977 |
| 6 | 7.613 | 255.548 |
| RSD（%） | 0.09 | 4.49 |
特異性
分析手順のバリデーションに関するICH Q2（R2）ガイドラインおよび中国薬局方一般章〈9101〉分析方法バリデーションに関するガイドラインに従い、最適化された方法について、特異性、直線性範囲、精度、および再現性を検証しました。
精製水と試料溶液（0.35 mg/mL）を並行して分析し、クロマトグラムを記録しました。結果（図3）は、精製水のクロマトグラムにおけるスペクチノマイシン塩酸塩の保持時間でクロマトグラフィーピークを示さなかった一方、試料溶液中のスペクチノマイシン塩酸塩のピークは、隣接するピークからベースライン分離を達成しました（R > 1.5）。
図3 スペクチノマイシン塩酸塩試料（0.35mg/mL）の分析結果
直線性範囲
スペクチノマイシン塩酸塩ストック溶液の3つの平行試料を標準溶液調製方法に従って調製し、クロマトグラフィー条件下で分析し、クロマトグラムを記録します。クロマトグラフィーピーク面積と対応する濃度を使用して回帰分析を実行します。
図4 直線性試験結果（対数変換対非変換）
文献によると、ELSD応答値と濃度の関係は非線形であり、回帰分析を実行する前に、応答値と濃度の両方を対数変換する必要があります[8,9,10]。実験データに対数変換を適用した後、線形回帰曲線の相関係数は0.999を超え、対数変換を行わないで得られた結果よりも有意に優れています（図4参照）。
精度と再現性
スペクチノマイシン塩酸塩ストック溶液を0.25、0.35、および0.50mg/mLの濃度に希釈しました。各濃度について、3つの平行試料を調製し、指定されたクロマトグラフィー条件下で分析し、クロマトグラムを記録しました。回帰曲線を使用して含有量を計算し、回収率と再現性を評価しました。結果を表6に示します。
表6 回収率試験結果
| No. | 実測値（mg/mL） | 計算値（mg/mL） | 回収率（%） | 回収率RSD（%） |
| 1 | 0.25 | 0.252 | 100.8 |
1.36 |
| 2 | 0.25 | 0.251 | 100.4 | |
| 3 | 0.25 | 0.246 | 98.4 | |
| 4 | 0.35 | 0.348 | 99.4 | |
| 5 | 0.35 | 0.352 | 100.6 | |
| 6 | 0.35 | 0.344 | 98.3 | |
| 7 | 0.50 | 0.505 | 101.0 | |
| 8 | 0.50 | 0.513 | 102.6 | |
| 9 | 0.50 | 0.504 | 100.8 |
定量限界（LOQ）
ストレプトマイシン塩酸塩ストック溶液を12μg/mLの濃度に希釈します。クロマトグラフィー条件下で試料を分析し、クロマトグラムを記録します。ストレプトマイシン塩酸塩のクロマトグラフィーピークのシグナル対ノイズ比（S/N）を計算し、その再現性を決定します。結果を表7に示します。
表7 LOQ試験結果
| No. | SNR | ピーク面積（SU*s） | ピーク面積RSD（%） |
| 1 | 15.647 | 3.416 |
8.45 |
| 2 | 10.634 | 2.928 | |
| 3 | 15.728 | 3.145 | |
| 4 | 12.842 | 3.529 | |
| 5 | 14.662 | 3.396 | |
| 6 | 11.076 | 3.730 |
結果は、ICHガイドラインの要件S/N > 10の下で、この濃度のスペクチノマイシン塩酸塩溶液のピーク面積の相対標準偏差が基準を満たしていることを示しています。したがって、スペクチノマイシン塩酸塩の定量限界基準として使用できます。
5. 結論
薬局方に基づき、本研究ではスペクチノマイシン塩酸塩の定量のための信頼性と堅牢な分析手順を確立しました。蒸発光散乱検出器（ELSD）の条件を体系的に最適化しました。最適化された方法は、安定性と精度が向上し、検出感度が高く、満足のいく直線性範囲を示しました。
ELSD3260検出器は、新しく設計および開発された低温、分割フロー検出器です。これは、非揮発性および半揮発性の物質の両方の分析に適しており、UV吸収を持たない化合物にとって貴重な代替手段を提供します。本研究では、スペクチノマイシン塩酸塩の分析にELSD3260を使用することで、優れた応答値と再現性、および検出感度の向上が得られました。これらの結果は、この機器がスペクチノマイシン塩酸塩の定量分析に適していることを示しています。
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