62/2000 乳幼児の健康を守ろう！ワンイーイオンクロマトグラフィーが7種類のヒトミルクを測定

前言

ヒトオリゴ糖（HMO）は、ヒト母乳中に天然に存在する、重合度3以下のオリゴ糖のグループであり、乳糖と脂肪に次いでヒト母乳中の3番目に多い固形分です。乳児の腸内細菌叢を調節し、特に乳児の腸内でのビフィズス菌の定着を促進すると同時に、腸内健康を維持し、免疫および脳の発達をサポートし、感染防御効果を発揮するなど、乳児の成長に重要な役割を果たしています。HMO強化粉ミルクが2015年に米国で初めて発売されて以来、HMOを含む幅広い種類の粉ミルク、牛乳・乳製品、消化器系健康補助食品、機能性食品が世界中で販売されています。2023年6月1日現在、米国とEUでは、2'-フコシルラクトース、3'-フコシルラクトース、ジフコシルラクトース、ラクト-N-ネオテトラオース、ラクト-N-テトラオース、3'-シアリルラクトース、6'-シアリルラクトースの7種類のHMOの使用が承認されています。

一般的なHMO検出方法の中で、液体クロマトグラフィーは検出前に誘導体化反応が必要であり、複雑なサンプル前処理を伴い、誘導体化試薬はしばしば毒性があります。また、HMOの熱不安定性はLC-MSでの応答性の低下と再現性の悪化につながります。対照的に、アンプロメトリック検出による炭水化物のイオンクロマトグラフィーは、簡単なサンプル前処理、高い応答性、良好な再現性を提供し、HMO分析において明確な利点があります。このアプリケーションノートでは、手動で調製した水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、超純水を発色剤として使用し、WAYEAL IC6300イオンクロマトグラフを用いて粉ミルク中のHMOを測定します。この方法は、簡単なサンプル前処理、高い感度、良好な直線性を示し、食品中のHMO検出に有用な参考情報を提供します。

キーワード：イオンクロマトグラフ；ヒトオリゴ糖；アンプロメトリック検出器。

1. 機器、装置および試薬

1.1 試薬および標準品

表1. 試薬および標準品リスト

1.2 実験室用材料および補助機器

• 1.2.1 分析天秤（読み取り精度0.1 mg）
• 1.2.2 定温水浴
• 1.2.3 遠心分離機
• 1.2.4 水性ポリエーテルスルホン（PES）メンブレンフィルター（0.45 µm）
• 1.2.5 超純水
• 1.2.6 真空ろ過装置
• 1.2.7 RP固相抽出（SPE）前処理カートリッジ
• 1.2.8 使い捨てシリンジ（20 mL、5 mL）。

2. 実験方法

2.1 溶液の調製

• 2.1.1 200 mmol/L 水酸化ナトリウム溶液：50% NaOH 10.5 mLをピペットで採取し、水で1000 mLに希釈し、真空ろ過する。
• 2.1.2 75 mmol/L NaOHおよび250 mmol/L 酢酸ナトリウム混合溶液：酢酸ナトリウム20.51 gを正確に秤量し、水に溶解して1000 mLメスフラスコに移す。50% NaOH 3.95 mLを正確にピペットで採取し、超純水で1000 mLに希釈し、真空ろ過する。
• 2.1.3 3% スルホン酸サリチル酸溶液：スルホン酸サリチル酸3.0 gを秤量し、水に溶解して100 mLに希釈する（新鮮に調製する）。
• 2.1.4 混合標準ストック溶液：2'-フコシルラクトース、3'-フコシルラクトース、3'-シアリルラクトース、6'-シアリルラクトース、ラクト-N-テトラオース、ラクト-N-ネオテトラオースをそれぞれ5 mg（小数点以下第1位まで正確に秤量）、10 mLメスフラスコに入れ、水に溶解して標線まで希釈し、500 mg/Lの混合ストック溶液を調製する。ジフコシルラクトースを1 mg（小数点以下第1位まで正確に秤量）、10 mLメスフラスコに入れ、溶解して標線まで希釈し、100 mg/Lのストック溶液を調製する。
• 2.1.5 混合標準作業溶液：混合ストック溶液（2.1.4）をメスフラスコに正確にピペットで採取し、水で希釈して、2'-FL、3'-FL、3'-SL、6'-SL、LNT、LNnT、DFLの混合作業溶液を0.5、2、4、6、8、10 mg/Lで調製する。使用前に新鮮に調製する。

2.2 サンプル前処理

サンプル約2.0 gを小型ビーカーに秤量し、50 mLの温水（約50℃）でよく混合し、3% スルホン酸サリチル酸溶液40 mLを加え、メスフラスコに移して100 mLに希釈し、10分間超音波処理する。ろ紙でろ過するか、遠心分離（12,000 rpm、15分）する。サンプル溶液をRP SPEカートリッジに通し、次に0.45 µmの水性メンブレンフィルターに通す。最初の3 mLを捨て、溶出液を分析用に採取する。使用前に、RP SPEカートリッジをメタノール20 mLでコンディショニングし、次に水15 mLでコンディショニングし、30分間平衡化する。

2.3 実験条件

2.3.1 イオンクロマトグラフィー条件

3. 結果

3.1 直線範囲

各混合標準作業溶液の適切なアリコートを分析した。直線範囲は0.5～10 mg/Lであり、測定濃度と名目上の濃度の偏差は最大許容偏差内であり、R²値は0.999以上であり、すべての成分は良好な直線性を示した。

表2. 化合物の直線範囲

図1. 7種類のHMO標準品のキャリブレーションクロマトグラムの重ね合わせ

3.2 サンプル試験結果

サンプル1および2は10倍希釈後に試験した。7種類のHMOの含有量は次のように計算した。Xはサンプル中の含有量（mg/100g）、cはキャリブレーション曲線から得られたサンプル溶液中の濃度（mg/L）、Vは一定の体積（mL）、mはサンプル質量（g）、fは希釈係数。計算された含有量（mg/100g）は次のとおりである。

図2. サンプル1の10倍希釈イオンクロマトグラム

図3. サンプル2の10倍希釈イオンクロマトグラム

表3. サンプル試験結果

3.3 精度

2.3.1の条件下で、第4キャリブレーションレベルの作業溶液を6回連続で注入して分析した。7種類のHMO含有量のRSDを計算して再現性を評価した。以下の結果は、良好な方法精度を示している。

3.3.1 標準品の再現性精度

試験結果：

図4. キャリブレーション標準品S4の独立した繰り返し注入のクロマトグラムの重ね合わせ

表4. 標準品の再現性精度

3.4 検出限界および定量限界

LOD：標準溶液のアリコートを、3'-FL 10 µg/L、DFL 30 µg/L、2'-FL 30 µg/L、LNnT 22 µg/L、LNT 67 µg/L、6'-SL 67 µg/L、3'-SL 160 µg/Lを含む混合溶液に希釈した。20個の並行サンプルを調製して分析した。

LOQ：標準溶液のアリコートを、3'-FL 30 µg/L、DFL 80 µg/L、2'-FL 90 µg/L、LNnT 65 µg/L、LNT 200 µg/L、6'-SL 200 µg/L、3'-SL 500 µg/Lを含む混合溶液に希釈した。6個の並行サンプルを調製して分析した。

試験結果は以下のとおりである。

表5. 7種類のHMOのLODおよびLOQのS/N結果

3.5 特異性

グルコース、フルクトース、スクロース、マルトースの標準溶液のアリコート（それぞれ100 µL）を10 mLメスフラスコに入れ、サンプル2溶液を67倍に希釈したものを用いて標線まで希釈した。この溶液を分析し、これらの糖が7種類のHMOのピークを妨害するかどうかを確認した。以下に示すように、4種類の糖は、粉ミルク中の7種類のHMOの測定に有意な妨害を示さなかった。

図5. キャリブレーションS6、サンプル2、および4種類の糖標準品をスパイクしたサンプル2のクロマトグラムの重ね合わせ

4. 結論

このバリデーションでは、WAYEALイオンクロマトグラフを使用して、食品中のHMOを測定する方法を検証した。データは、すべてのクロマトグラフィーピークがテーリングなく良好な形状を示していること、2'-FL、3'-FL、DFL、LNnT、LNT、6'-SL、3'-SLがすべて60分以内に溶出すること、感度が国家標準の要件を満たしていること、線形相関係数がすべて0.999を超えていることを示している。標準品とサンプルの両方の再現性は良好である。2種類のシアリルラクトースを除き、LODおよびLOQはµg/Lレベルである。この方法は良好な特異性を持ち、妨害する不純物は見つからず、全体として標準要件を満たしている。