Wayeal LCMS-TQ9200 LC-MS/MS システムによる、含油作物中のグループ 1 発がん物質であるアフラトキシン B₁ の測定

アフラトキシンB₁主に次の物質によって生成される非常に有毒な二次代謝産物です。 アスペルギルス・フラバスそしてアスペルギルス・パラシティカス。アフラトキシンファミリーの中で最も強い毒性を示し、最も広範囲に分布しています。それは、細胞内 DNA および RNA 合成を阻害し、タンパク質代謝を妨害することによって毒性効果を発揮し、肝臓に高度に標的を絞った損傷効果をもたらします。オクラトキシンやパツリンなどの他のカビ毒と比較して、アフラトキシン B₁非常に有毒であり、発がん性が確立されています。として分類されています。 グループ 1 発がん物質世界保健機関(WHO)による。これは、ピーナッツ、トウモロコシ、ナッツ、植物油などの含油作物で頻繁に検出され、世界中の食品安全管理における優先汚染物質となっています。

アフラトキシンBによる汚染₁通常、油を含む作物が植え付け、収穫、または保管中に高温および高湿度の条件にさらされた場合に発生し、真菌の増殖が促進されます。また、アフラトキシン B は化学的性質が安定しているため、₁従来の調理温度では破壊できないため、農産物や加工食品における残留問題が繰り返し発生します。

短期間に大量に摂取すると、激しい腹痛、嘔吐、黄疸、肝不全などの症状を示す急性中毒を引き起こす可能性があり、重篤な場合には死に至る可能性があります。長期にわたる低線量被曝は肝臓への蓄積をもたらし、肝線維症や肝硬変などの慢性肝障害を誘発し、さらには原発性肝がんを引き起こす可能性があります。子供、高齢者、既存の肝疾患のある人など、免疫力が低い人々は、アフラトキシン B のリスクが高くなります。₁中毒。

中国では、国家基準 GB 2761-2017 (国家食品安全基準 – 食品中のマイコトキシンの最大レベル) により、アフラトキシン B の最大残留制限が指定されています。₁さまざまな種類の食品に。さらに、 GB 5009.22-2016 (国家食品安全基準 – 食品中のアフラトキシン B および G の測定)アフラトキシン B を測定するための公式の分析方法を提供します₁。

このアプリケーションノートでは、アフラトキシン B を測定するための同位体希釈液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析 (LC-MS/MS) 法の確立について説明します。₁Wayeal LCMS-TQ9200 LC-MS/MS システムを使用します。

キーワード:トリプル四重極。アフラトキシンB₁;同位体希釈液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析。

1. 機器と試薬

1.1 機器の構成

表 1 機器構成リスト

1.2 試薬と標準物質

表 2 試薬と標準品

1.3 実験材料および補助装置

ボルテックスミキサー

高速遠心分離機

分析天びん

遠心

固相抽出（SPE）マニホールド（真空ポンプ付）

窒素蒸発器

シェーカー

2. 実験方法

2.1 溶液の準備

2.1.1 5 mmol/L 酢酸アンモニウム溶液:酢酸アンモニウム0.39gを量り、水に溶かして1000mLに希釈します。よく混ぜます。

2.1.1 メタノール-アセトニトリル溶液:アセトニトリル 100mL をメタノール 100mL に加え、よく混合します。

2.2 サンプルの前処理

2.2.1 サンプルの抽出

小麦粉を目開き2mmの試験用ふるいに通します。サンプル 5g (0.01g までの精度) を量り、50mL 遠心分離管に入れます。 100を追加μ同位体内部標準作業溶液 (100ng/mL) を 1L 加え、ボルテックスで混合し、30 分間放置します。 20 mL のメタノール-水溶液 (70+30、v/v) を加え、ボルテックスして混合し、オービタルシェーカーで 20 分間振盪します。 6000r/minで10分間遠心分離します。後で使用するために上清を収集します。

2.2.2 サンプルの精製

上清 4 mL を容器に正確に移し、1% Triton X-100 in PBS 23 mL を加え、よく混合します。

イムノアフィニティーカラム内の元の液体が完全に排出された後、上記のサンプル溶液を 50 mL のシリンジバレルに移します。試料溶液が 1 ～ 3 mL/min の速度でカラムを安定して通過するように流量を調整します。サンプル溶液が完全に排出された後、シリンジバレルに 2 × 10 mL の水を加え、一定の流速で免疫アフィニティーカラムを洗浄します。水を排出した後、真空ポンプを使用してカラムを乾燥させます。

真空システムを取り外します。 10 mL 目盛り付き試験管をイムノアフィニティ カラムの下に置き、50 mL シリンジ バレルを取り外し、1 mL のメタノールを 2 回加えて、1 ～ 3 mL/min の制御された流速でカラムを溶出します。その後、真空ポンプを使用してカラムを再度乾燥させます。溶出液をすべて試験管に集めます。50 °C の窒素気流下で、溶出液をほぼ乾燥するまでゆっくりと蒸発させます。 1 mL の初期移動相を加え、30 秒間ボルテックスして残留物を溶解します。 0.22 μm メンブレンフィルターで濾過し、その後の注入のためにオートサンプラーバイアルに濾液を集めます。

2.3 実験条件

2.3.1 液体クロマトグラフィー法

カラム：C18、1.7μメートル、2.1×50mm

移動相 相: A: メタノール-アセトニトリル溶液。 B相：5mmol/L酢酸アンモニウム溶液

流量: 0.3 mL/分

カラム温度: 40°C

注入量: 3μL

2.3.2 質量分析法

表 3 化合物質量分析パラメータ

注: アスタリスク (*) は定量的イオンを示します。

3. 実験結果

3.1 標準クロマトグラム

アフラトキシン B の測定₁同位体内部標準 13C17-アフラトキシン B₁5分以内に完了しました。図 1 に示すように、両方の分析物は優れたピーク形状と満足のいく応答を示し、実験分析の要件を満たしていました。

図 1 アフラトキシン B のクロマトグラム₁同位体内部標準 13C17​-アフラトキシンB₁

3.2 線形範囲

適切な量​​の標準ストック溶液と混合同位体内部標準作業溶液を正確に移し、最初の移動相で希釈して、アフラトキシン B を含む一連の標準作業溶液を調製しました。₁濃度は 50、20、10、5、2、1、0.5ng/mL です。各溶液には同位体内部標準が 2ng/mL の濃度で含まれていました。これらの標準を使用して検量線を作成しました。 0.5 の線形範囲にわたって–50ng/mL、13C 17-アフラトキシンBによる補正後₁内部標準として、測定されたアフラトキシン B と公称アフラトキシン B の間の偏差₁濃度は最大許容偏差内でした。相関係数 (R) は 0.999 より大きく、優れた直線性を示しました。

図 2 アフラトキシン B の標準曲線₁

3.3 再現性

3 つの濃度 (1、10、および 20 ng/mL) の標準溶液を 6 回連続して注入しました。結果を以下の表に示します。アフラトキシン B の保持時間とサンプル量の相対標準偏差 (RSD)₁低濃度、中濃度、高濃度ですべて 5% 以内であり、実験の要件を満たしていました。

表 4 アフラトキシン B の再現性試験₁低、中、高濃度で

3.4 スパイクの回復

アフラトキシンB₁標準溶液をサンプルに添加して、最終濃度 5ng/mL を達成しました。次に、スパイクされたサンプルを LC-MS/MS によって分析しました。 6 回の連続注射の平均結果は 5.147ng/mL、RSD は 1.954% でした。計算された回収率は 102.94% であり、実験の要件を満たしています。

3.5 ブランク残基

20 ng/mL 標準溶液を連続注入した後、引き続きブランクサンプルを注入してキャリーオーバーを評価しました。図 3 に示すように、ブランクサンプルではキャリーオーバーは検出されませんでした。

図 3 化合物のブランククロマトグラム

3.6 サンプルテスト

アフラトキシンB₁サンプル A では検出されませんでした (図 4)。

図 4 アフラトキシン B のクロマトグラム₁サンプルAでは

4. 結論

この研究では、アフラトキシン B の定量のための同位体希釈液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析 (LC-MS/MS) 法を使用します。₁Wayeal LCMS-TQ9200 液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析システムを使用して確立されました。得られたデータは、すべてのクロマトグラフィー ピークがテーリングのない良好なピーク形状を示していることを示しています。感度は実験要件を満たしており、相関係数 (R) は 0.999 より大きく、直線性の基準を満たしています。低、中、高濃度での再現性は 5% 以内であり、高濃度サンプル注入後のシステムキャリーオーバーは観察されません。これらの結果は、この方法が Wayeal 液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析システムを備えている場合、対象サンプルの日常的な定性および定量分析の要件を満たすことを示しています。